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克隆感受態_電轉

TOP10 Electro

文字:[大][中][小] 2016-11-4    瀏覽次數:3207    

TOP10 Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1010)

TOP10 Electroporation-Competent Cell                  50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                 10μl

保存條件(保質期):                                          -80℃(6個月)


基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG




產品說明

TOP10電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。TOP10來源于MC1061菌株,是目前實驗室最常用的感受態細胞之一,基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型,而TOP10為galU型)。TOP10生長速度快 (比DH5α快,但比Mach1-T1生長速度慢),10小時可見克隆。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取??捎糜跇嫿寺?,藍白斑篩選等實驗。TOP10電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。

 

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙

醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中

靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的TOP10電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蜻B接產物)

并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

B. 對于連接產物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重

懸,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用

電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入1ml不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml

槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中

補加S.O.C. 培養基至10 ml。傾斜45度放入搖床,37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,

若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。



S.O.C 培養基配方


2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0 

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 

 

注意事項

1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;蛳氆@得較高轉化效率,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蜻B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。




說明書下載

TOP10 Electroporation-Competent Cell 產品說明書


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