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克隆感受態_電轉

XL1-Blue Electro

文字:[大][中][小] 2016-11-4    瀏覽次數:3103    

XL1-Blue Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1030)

XL1-Blue Electroporation-Competent Cell             50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期):                                         -80℃(6個月)



基因型


recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 (rk-,mk+), relA1 lac [F' proAB lacIqZ?M15: Tn10 (TetR)]


 

產品說明


XL1-Blue電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。XL1-Blue菌株能保證高拷貝質粒穩定復制,recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。hsdR17突變導致EcoK核酸內切酶系統缺失,增強了外源DNA的穩定性和提取質量。 lacIqZΔM15 的存在使XL1-Blue菌株可用于藍、白斑篩選。此菌株具有四環素抗性。XL1-Blue電擊感受態細胞適用于各種文庫構建,經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。


操作方法

1. 0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. -80℃保存的XL1-Blue電擊感受態細胞插入冰中分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

B. 對于連接產物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重懸,DNA濃度不超過100ng/μl,體積不超過5μl/50μl 感受態。

3. 200 μl槍頭將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50ml離心管(BD Falcon50ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養基至5ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。


S.O.C 培養基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

 

注意事項

1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;蛳氆@得較高轉化效率,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時不可用孔徑過小的槍頭 (普通200ul槍頭應剪去槍頭尖0.6cm) 避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蜻B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。




說明書下載

XL1-Blue Electroporation-Competent Cell 產品說明書

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