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克隆感受態_電轉

EPI300 Electro

文字:[大][中][小] 2018-1-31    瀏覽次數:2372    

EPI300 Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1084)

EPI300 Electroporation-Competent Cell                50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期):                                         -80℃(6個月)


基因型

F – mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara,leu)7697 galU galK λ – rpsL nupG trfA dhfr.


產品說明

EPI300電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。EPI300細胞含有一個突變的trfA基因,該基因表達出的蛋白產物可以促進含有ori V復制子的質粒的高拷貝擴繁,誘導劑Ⅰ可以誘導trfA基因的表達。當含有ori V復制子質粒的EPI300細胞在LB/2YT或SOB培養基中生長時,trfA基因的表達被抑制,ori V復制子質粒的拷貝數維持在很低的水平;當在培養基中加入誘導劑Ⅰ,ori V復制子質粒的拷貝數可維持在很高的水平,提高了質粒產量。因此EPI300菌株可以降低ori V復制子質粒的拷貝數,特別適合于各種不穩定 DNA 或毒性基因的克隆。 [mcrA,Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI300菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA(例如:哺乳動物基因組DNA)。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacZΔM15 標記的存在使EPI300可用于藍白斑篩選,rpsL賦予其鏈霉素抗性。此外,EPI300電擊感受態細胞轉化效率極高,特別適用于文庫構建,唯地生物生產的EPI300電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率>2×1010 cfu/μg DNA。


操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的EPI300電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

    A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

    B. 對于連接產物,大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與EPI300電擊感受態混合后電擊轉化,無             需進行DNA純化,但DNA濃度不能過高,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

    C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                   EDTA)重懸,然后與EPI300電擊感受態混合進行電擊轉化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。



S.O.C 培養基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0


S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 


注意事項

1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;蛳氆@得較高轉化效率,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,部分公司的連接體系或重組體系(例如:Thermo,NEB公司的T4 連接酶系統,NEB,天根的50度反應重組系統)可以直接與EPI300電擊感受態混合后電擊轉化,無需純化,但DNA濃度不能過高,最好不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蜻B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。





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EPI300 Electroporation-Competent Cell 產品說明書

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