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克隆感受態_電轉

DH10B-Plus Electro

文字:[大][中][小] 2018-6-20    瀏覽次數:2330    

DH10B-Plus Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1072)

DH10B-Plus Electroporation-Competent Cell                50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                        10μl

保存條件(保質期):                                                 -80℃(6個月)


基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG Hte(TetR)


產品說明

DH10B-Plus電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。DH10B-Plus菌株來源于DH10B菌株,在DH10B菌株中引入Hte突變,提高了細胞膜的通透性和對瞬時高壓的耐受進而提高了電擊轉化效率。DH10B- Plus菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (無論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉入DH10B- Plus中)。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取,?80dlacZ ΔM15標記的存在使DH10B-Plus可用于藍白斑篩選。DH10B-Plus電擊感受態細胞具有鏈霉素和四環素抗性,適用于大質粒的構建或各種文庫構建,經特殊工藝處理,pUC19質粒檢測轉化效率>2×1010 cfu/μg DNA。


操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的DH10B-Plus電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

        A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

        B. 對于連接產物,大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與DH10B-Plus電擊感受態混合后電擊轉               化,無需進行DNA純化,但DNA濃度不能過高,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

        C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                   EDTA)重懸,然后與DH10B-Plus電擊感受態混合進行電擊轉化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。


S.O.C 培養基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0


S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 


注意事項

1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10,電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

2. DH10B-Plus菌株有鏈霉素和四環素抗性,不可用于具有鏈霉素或四環素抗性質粒的轉化。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;蛳氆@得較高轉化效率,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物或文庫轉化,DNA濃度及鹽離子濃度不可過高,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或文庫DNA會降低轉化效率,鹽離子濃度過高會增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蜻B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。




說明書下載

DH10B-Plus Electroporation-Competent Cell 產品說明書


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