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農桿菌感受態_電轉

GV3101 (pJIC SA_Rep) Electro

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GV3101 (pJIC SA_Rep) Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格 (CAT#: AE1004)

GV3101 (pJIC SA_Rep) Elec:                                      50μl/支
pGs2(control vector,10ng/μl )                                     10μl
保存條件(保質期):                                          -80℃(12個月) 

 

基因型


C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pJIC SA_Rep -tetR)



產品說明

GV3101(pJIC SA_Rep)菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉化操作,此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞,但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質粒含有篩選標簽:gent,賦予GV3101菌株慶大霉素抗性;在GV3101菌株中轉入help質粒:pJIC SA_Rep即為GV3101(pJIC SA_Rep)菌株,可幫助pgR106,pgR107,pGreen,pGs2系列質粒在農桿菌中復制,同時賦予該菌株四環素(tet)抗性,適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。唯地生物開發的GV3101(pJIC SA_Rep)電轉感受態特別適用于大質粒的轉化:經pGs2(卡那霉素抗性)質粒檢測轉化效率>106 cfu/μg。

 

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質粒DNA(體積不大于6ul,感受態轉化效率較高,第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量),用手撥打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態-質?;旌衔锟焖僖频诫姄舯?,蓋上杯蓋,空管保留待用。

3. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態空管中,28℃振蕩培養2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養箱培養2-3天

       平板只含有50 μg/ml kan 時,28℃培養48 h即可;平板中同時加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,需28℃培     60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90 h)。



備注

1、農桿菌相關抗生素配方:

抗生素

配方

原液

工作液

羧芐青霉素(carb

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

硫酸卡那霉素(kan

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

50 mg/ml

50 μg/ml

鏈霉素(strep

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

10 mg/ml

50 μg/ml

利福平(rif

DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

10 mg/ml

20 μg/ml

慶大霉素(gent

雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌

20 mg/ml

40 μg/ml

 

2、常用農桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)

農桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

慶大霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

AGL-1

R

S

R

S

S

EHA101

S

S

R

S

R

EHA105

S

S

R

S

S

LBA4404

S

R

R

S

S

GV3101

S

S

R

R

S 

3、LBYEB配方:

component

LB(液體)/L

LB(固體)/L

component

YEB(液體)/L

YEB(固體)/L

Tryptone

10 g

10 g

Tryptone

5 g

5 g

Yeast extract

5 g

5 g

Yeast extract

1 g

1 g

NaCl

10 g

10 g

牛肉浸膏

5 g

5 g

NaOH 

調PH7.0

調PH7.0

蔗糖

5 g

5 g

Agar

15 g

MgSO4*7H2O

0.49 g

0.49 g

 

 

 

NaOH 

調PH7.0

調PH7.0

 

 

 

Agar

15 g


注意事項

1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10;質粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉化效率急劇下降;質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

2. 轉化高濃度的質??上鄳獪p少最終用于涂板的菌量,本公司生產的GV3101(pJIC SA_Rep)感受態細胞具有四環素抗性,但在轉入目標質粒涂板篩選陽性克隆時,只需加入目標質??剐缘目股?,不加四環素。

3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應減少質粒用量。

4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農桿菌生長,會降低其生長速度和轉化效率。

5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌;根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質粒丟失,但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作,培養農桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti質粒丟失的概率極低 (可以忽略)。





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GV3101 (pJIC SA_Rep) Electroporation-Competent Cell 產品說明書

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