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克隆感受態_電轉

Stbl4 Electro

文字:[大][中][小] 2019-2-26    瀏覽次數:1944    

Stbl4 Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1047)

Stbl4 Electroporation-Competent Cell                   50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期):                                         -80℃(6個月)


基因型

FproAB+ lacIqZ?M15 Tn10 (TetR)mcrA ?(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1?(lac-proAB)


產品說明

Stbl4菌株來源于 Stbl2 E. coli strain,可用于慢病毒載體或逆轉錄病毒載體的構建。Stbl4菌株適合克隆不穩定插入片段 (正向重復序列,逆轉錄病毒序列等);mcrA突變和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使該菌株更適于克隆甲基化的基因組序列。recA 1和endA1的突變有利于克隆DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。lacIqZΔM15標記使得Stbl4菌株可用于藍、白斑篩選,此菌株具有四環素抗性。唯地生物生產的Stbl4電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達0.5×1010 cfu/μg DNA,特別適合于慢病毒質粒文庫或逆轉錄質粒文庫的構建。


操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電擊杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的Stbl4電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蜻B接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

       A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

       B. 對于連接產物,大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與Stbl4電擊感受態混合后電擊轉化,無需            進行DNA純化,但DNA濃度不能過高,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

       C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                  EDTA)重懸,然后與Stbl4電擊感受態混合進行電擊轉化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。30℃,225 rpm復蘇90分鐘。當質粒中含有不穩定片段時,30℃培養可降低錯誤重組的概率,若轉化control pUC19計算轉化效率,則需37℃,225 rpm復蘇60分鐘

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的LB平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養17-20小時或30℃培養箱過夜培養20-24小時。若轉化control pUC19計算轉化效率,則需37℃培養過夜。

7.若要獲得大量,高純度質粒,建議在TB培養基中30度搖菌培養(以標準質粒PUC19為例:500ml三角瓶中加入100ml TB營養液,經30度250rpm搖菌,可提取約100-200ug PUC19質粒)


S.O.C 培養基配方       

     2% Tryptone                          

1.2%     Tryptone

2.4% Yeast Extract

4%        甘油

17mM   KH2PO4

72mM   K2HPO4

    

TB培養基配方               

1.2%     Tryptone                                          

2.4% Yeast Extract                                             

4%        甘油                                                   

17mM   KH2PO4                                          

72mM   K2HPO4                                            


配制方法(1L):1,配制磷酸緩沖液(0.17M  KH2PO4, 0.72M  K2HPO4):

溶解2.31g KH2PO4和 12.54g K2HPO4于90ml去離子水中,定容到100ml,高壓滅菌。2,在燒杯中加入以下試劑:Tryptone  12g, Yeast Extract  24g,甘油  4ml;加入去離子水800ml,充分溶解后,定容至900ml,高壓滅菌。待溶液冷卻至60度以下,加入100ml 滅菌磷酸鹽緩沖液。


S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 


注意事項

1. Stbl4電擊感受只能電擊轉化,不可用熱激方法轉化。加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;蛳氆@得較高轉化效率,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,部分公司的連接體系或重組體系(例如:Thermo,NEB公司的T4 連接酶系統,NEB,天根的50度反應重組系統)可以直接與Stbl4電擊感受態混合后電擊轉化,無需純化,但DNA濃度不能過高,最好不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蜻B接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。




說明書下載

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